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如何在掃描電鏡中進(jìn)行樣品冷凍以減少電子束損傷?

日期:2024-10-16

掃描電子顯微鏡 (SEM) 中,對某些敏感樣品進(jìn)行冷凍處理可以顯著減少電子束損傷,特別是對一些生物樣品、聚合物或其他低導(dǎo)電性材料。冷凍 SEM 技術(shù)(Cryo-SEM)通過將樣品快速冷凍并維持低溫環(huán)境來避免電子束引起的樣品變形或損壞。以下是如何在 SEM 中進(jìn)行樣品冷凍以減少電子束損傷的步驟和方法。

1. Cryo-SEM 的原理

Cryo-SEM(冷凍掃描電鏡)通過快速冷凍樣品并維持在低溫度下成像,避免了電子束在樣品上產(chǎn)生的熱效應(yīng)和化學(xué)變化。這種方法的主要目的是:

防止水分蒸發(fā),特別是對含水的生物樣品或水凝膠類材料。

通過降低溫度來減少電子束引起的損傷、熱效應(yīng)和樣品帶電效應(yīng)。

保持樣品的自然狀態(tài)而不需要進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)固定或鍍膜。

2. 樣品制備步驟

冷凍 SEM 樣品的制備是 Cryo-SEM 成像中關(guān)鍵的部分。以下是典型的樣品制備流程:

1) 快速冷凍(快速凍結(jié))

樣品需要通過快速冷凍(通常稱為 vitrification)來保持樣品原始狀態(tài),避免冰晶的形成。

常用的方法包括浸入冷凍或高壓冷凍。浸入冷凍:將樣品快速浸入液氮或液氮溫度的液體(如液態(tài)丙烷)。這一過程可使水分以玻璃態(tài)(非晶態(tài))凍結(jié),避免晶體冰的形成。

高壓冷凍:使用高壓冷凍裝置對樣品施加高壓,迅速降低溫度以抑制冰晶生成。

2) 轉(zhuǎn)移到冷凍樣品臺(tái)

冷凍后的樣品需要在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)移到 SEM 的冷凍樣品臺(tái)上。這通常是通過冷凍轉(zhuǎn)移桿進(jìn)行的,確保樣品不與環(huán)境接觸,避免升溫。

樣品的溫度通常保持在 -140°C 到 -196°C,具體取決于樣品的特性和成像要求。

3) 樣品鍍膜

雖然低溫可以減少樣品損傷,但仍然有些樣品(如絕緣材料或生物樣品)在電子束下可能產(chǎn)生帶電效應(yīng)。這時(shí)可以使用低溫鍍膜技術(shù)(通常為金、鉑或碳),在樣品表面沉積一層導(dǎo)電薄膜來減少帶電效應(yīng)。

鍍膜過程也須在低溫下進(jìn)行,以保持樣品的冷凍狀態(tài)。

3. SEM 冷凍系統(tǒng)操作

冷凍樣品準(zhǔn)備好后,需要將其插入到 SEM 中的冷凍系統(tǒng)?,F(xiàn)代 Cryo-SEM 通常配備了冷凍臺(tái)和低溫裝置,可以穩(wěn)定保持樣品的冷凍狀態(tài)。

1) 加載樣品

使用冷凍轉(zhuǎn)移桿將樣品從冷凍準(zhǔn)備臺(tái)轉(zhuǎn)移到 SEM 的冷凍樣品室。

樣品被安裝在冷凍樣品臺(tái)上,并通過液氮冷卻系統(tǒng)保持低溫。

2) 調(diào)節(jié)溫度

通過 SEM 的軟件接口,可以設(shè)定并監(jiān)控樣品臺(tái)的溫度。通??刂圃?-150°C 到 -190°C,具體取決于樣品的特性。

樣品在整個(gè)成像過程中需要保持在設(shè)定溫度,以避免由于溫度波動(dòng)而導(dǎo)致樣品變形或損壞。

4. 電子束設(shè)置與操作

在 Cryo-SEM 中,電子束的參數(shù)設(shè)置也應(yīng)根據(jù)樣品的低溫特性進(jìn)行調(diào)整,以進(jìn)一步減少電子束損傷:

降低加速電壓:低導(dǎo)電性樣品容易受到電子束損傷,因此需要使用較低的加速電壓(例如 1 kV 到 5 kV),減少對樣品的損傷。

降低束流密度:減少電子束的強(qiáng)度和束流密度也能降低熱效應(yīng)和損傷。

控制掃描速度:通過使用較慢的掃描速度,能夠進(jìn)一步減小熱累積,并有助于減少對樣品的損壞。

5. 低溫成像技術(shù)

在低溫環(huán)境下進(jìn)行成像可以大幅減少樣品的損傷,特別是在生物學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域。以下是兩種常見的成像方式:

1) 冷凍斷裂法(Cryo-fracture)

對于細(xì)胞或其他多層樣品,冷凍斷裂技術(shù)能夠在低溫度下將樣品斷裂,暴露內(nèi)部結(jié)構(gòu)。隨后可直接在 SEM 中成像,以觀測次表面結(jié)構(gòu)。

樣品斷裂后,仍需保持在冷凍臺(tái)上,并進(jìn)行成像操作。

2) 冷凍蝕刻(Cryo-etching)

在某些情況下,樣品表面被冷凍覆蓋的物質(zhì)(如水分)會(huì)影響成像。冷凍蝕刻可以通過逐步升溫,讓樣品表面升溫到略高于冷凍溫度(如 -90°C 到 -100°C),以輕微升華表面水分,暴露出樣品的表面結(jié)構(gòu)。

該過程使樣品表面更加清晰,有利于高分辨率成像。

6. 成像后處理與升溫

在成像結(jié)束后,樣品通常需要經(jīng)過升溫和解凍處理:

升溫控制:逐步升溫可以避免樣品因快速升溫而破壞結(jié)構(gòu),特別是在需要進(jìn)一步處理或分析的情況下。

樣品處理:根據(jù)樣品性質(zhì),可以在升溫后對其進(jìn)行其他表面處理、化學(xué)分析或保存。

以上就是澤攸科技小編分享的如何在掃描電鏡中進(jìn)行樣品冷凍以減少電子束損傷。更多掃描電鏡產(chǎn)品及價(jià)格請咨詢15756003283(微信同號(hào))。

掃描電鏡


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作者:澤攸科技


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