如何在掃描電鏡中進行高分辨率的斷層掃描
日期:2024-08-30
在掃描電子顯微鏡(SEM)中進行高分辨率的斷層掃描(通常稱為Serial Block-Face Imaging或FIB-SEM斷層掃描)是獲取樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)。通過逐層去除樣品材料并對暴露的表面進行成像,可以生成樣品的三維結(jié)構(gòu)。以下是如何在SEM中進行高分辨率斷層掃描的詳細步驟:
1. 樣品準備
樣品固定: 將樣品固定在SEM樣品臺上,確保在整個斷層掃描過程中樣品位置保持穩(wěn)定。
樣品鑲嵌和包埋: 對于某些生物或軟材料樣品,通常需要先進行固定和包埋處理,以增強樣品的機械強度和對電子束的耐受性。
導電性處理: 非導電性樣品應進行金屬噴鍍(如金或鉑),或使用導電樹脂包埋,以防止充電效應。
2. 斷層掃描技術(shù)選擇
斷層掃描在SEM中有兩種常見方法:
A. Serial Block-Face Imaging (SBF-SEM)
原理: 使用一個超薄切片器(通常是一個鉆石刀)在樣品表面進行逐層切片,然后在每次切片后對暴露的表面進行成像。
適用性: 適用于軟材料或生物樣品,可以生成高分辨率的三維圖像。
B. Focused Ion Beam (FIB-SEM)
原理: 使用聚焦離子束(FIB)逐層去除樣品的表面材料,每去除一層后,用SEM成像。FIB通常由加速的鎵離子束實現(xiàn),具有很高的材料去除精度。
適用性: 適用于硬質(zhì)材料和精細結(jié)構(gòu)的三維重建,能夠提供非常高的分辨率。
3. 成像參數(shù)設(shè)置
加速電壓: 使用適合材料的加速電壓。對于硬材料,通常使用高加速電壓(如10-30 kV),對于生物材料,可能使用較低的電壓(如1-5 kV)。
電子束電流: 選擇合適的探針電流,確保每一層的表面成像具有足夠的信噪比,同時避免損傷樣品表面。
工作距離: 調(diào)整工作距離以優(yōu)化分辨率,同時確保電子束能夠準確聚焦在樣品表面。
4. 逐層成像
層厚控制: 使用切片器或FIB逐層去除樣品材料,每次去除的層厚度應盡量小,以提高斷層掃描的分辨率。層厚度通??刂圃诩{米級。
圖像采集: 每去除一層后,立即對暴露的表面進行成像。確保成像參數(shù)保持一致,以獲得連貫的三維圖像序列。
5. 圖像處理和三維重建
圖像對齊: 將每一層的圖像進行對齊,以確保三維重建過程中圖像的準確性。圖像對齊可以通過自動對齊算法或手動調(diào)整來實現(xiàn)。
圖像去噪: 對采集的圖像序列進行去噪處理,消除可能的成像偽影或噪聲,提高圖像質(zhì)量。
三維重建: 使用三維圖像處理軟件(如Amira、Avizo等)將對齊后的圖像序列進行三維重建,生成樣品的三維模型。
分析和可視化: 對重建的三維模型進行分析和可視化處理,測量內(nèi)部結(jié)構(gòu)的尺寸和形態(tài),提取感興趣的特征。
6. 數(shù)據(jù)分析
斷層分析: 對重建的三維圖像進行斷層分析,可以研究樣品內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)、形態(tài)學特征和材料分布。
定量分析: 通過測量和統(tǒng)計分析,可以量化樣品的三維結(jié)構(gòu)信息,例如孔隙率、顆粒尺寸分布、纖維取向等。
注意事項
樣品選擇: 樣品的機械強度和導電性對斷層掃描的效果有顯著影響。硬質(zhì)材料或?qū)щ娦粤己玫臉悠吠ǔD塬@得更好的成像效果。
儀器維護: 確保SEM和FIB設(shè)備處于良好狀態(tài),尤其是在長時間的斷層掃描過程中,穩(wěn)定的設(shè)備性能至關(guān)重要。
層厚控制: 準確控制每次去除的層厚度對于高分辨率斷層掃描至關(guān)重要,特別是在需要重建微小結(jié)構(gòu)時。
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作者:澤攸科技